Funkcjonalna ekspresja zmutowanego nabłonka pseudohypoaldosteronizmu typu I na kanale Na + pozbawionym regionu tworzącego pory jego podjednostka ad 6

Stosując przeciwciało anty-szczurze. ENaC, byliśmy w stanie wydajnie immunoprecypitować zarówno podjednostki szczurze jak i ludzkie. ENaC. Ten eksperyment wykazał wydajną translację obu zmutowanych białek. Co ważne, nie wykryto dowodów znaczącego odczytu transkrypcyjnego kodonu stop (rysunek 5a). Żadnej wczesnej degradacji zmutowanego kompleksu lub różnicy w obrotach białek nie można wykazać za pomocą eksperymentów impuls-chase (nie pokazano). Figura 5 (a) Denaturująca immunoprecypitacja z przeciwciałem anty-szczurzej ENaC. Oocytom wstrzyknięto szczur typu dzikiego . (linia 1), szczur. L535stop. (linia 2), ludzki typ dziki. (linia 3) lub człowieka. R508stop. (ścieżka 4) i były znakowane metabolicznie. Równe ilości preparatu mikrosomalnego poddano immunoprecypitacji przez szczura anty-. przeciwciało. Odzyskane immunoprecypitaty przeprowadzono na żelu 5,58% SDS-poliakrylamid. Wskazano masę cząsteczkową. (b) Nieendenaturująca koimmunoprecypitacja RENaC typu dzikiego i zmutowanego. Oocytom wstrzykiwano podjednostki p FLAG (ścieżki 1, 3 i 5), podjednostką A155ostopFLAG (linia 2), lub bez podjednostki FLAG (ścieżki 4 i 6), współpodawane z dzikim typem rENaC lub zmutowanymi podjednostkami A5.535, jako wskazany. Nieenenaturującą koimmunoprecypitację przeprowadzono z mAb anty-FLAG. Swoistość przeciwciała pokazano na ścieżkach 4 i 6 (bez podznak podznakowanych FLAG). Swoistość koimmunoprecypitacji wykazano na ścieżkach 2, 3 i 5 (bez iniekcji podjednostki a). Zgromadzenie. L535stop z. i . podjednostki oceniano za pomocą nieendenacji immunoprecypitacji błon mikrosomalnych przygotowanych z oocytów z wstrzykniętym ENaC znakowanym [35S] metioniną. Figura 5b pokazuje autoradiogram żelowego SDS-poliakryloamidowego, demonstrując zestawienie. L535stop z dołączonym znacznikiem FLAG razem z. i . Podjednostki ENaC (linia 2). Swoistość zestawu oceniano zmieniając podjednostkę z tagiem FLAG tego kompleksu (linia 3). . Podjednostka oznaczona FLAG była także zdolna do koimmunoprecypitacji. L535stop z. podjednostka. Swoistość przeciwciała pokazano na ścieżkach 4 i 6, gdzie zastosowano nieotagowane zmutowane podjednostki i oocyty z iniekcją wody. Na koniec, specyficzność koimmunoprecypitacji jest zademonstrowana przez oocyty, którym wstrzyknięto. (ścieżka 5), w której 2 białka są połączone. Wyniki te wskazują, że zmutowana podjednostka A535ostop koasli się z. i a, pomimo delecji jej drugiej domeny przezbłonowej i ogona wewnątrzkomórkowego z końca COOH. Aby ocenić obecność wszystkich 3 podjednostek na powierzchni komórki, wykorzystaliśmy również test wiązania z podjednostkami oznaczonymi epitopem. Trzy dni po wstrzyknięciu, sygnał wiązania dla oocytów, którym wstrzyknięto. L535stopFLAG. znajdował się w tym samym zakresie, co dla oocytów, którym wstrzyknięto FL535 stop FLAGFAGAG, a prądy wrażliwe na amiloryd były identyczne (Figura 6). Wraz z wynikami testu wiązania (Figura 3a) i testu koimmunoprecypitacji (Figura 5b), nasze dane wskazują, że 3 podjednostki ENaC są obecne na powierzchni komórki i są zmontowane, tworząc aktywny kanał. Figura 6 Wykrywanie powierzchni komórkowej podjednostek znakowanych FLAG. Oocyty wstrzyknięto. FLAG. FLAG (wypełnione słupki),. L535stop. FLAG. FLAG (otwarte słupki),. L535stopFLAG. (jasnoszare słupki) lub. FLAG. FLAG (ciemnoszare słupki). Po 3 dniach inkubacji przeprowadzono test wiązania i określono liczbę cząsteczek znakowanych FLAG obecnych na powierzchni komórki. Wartości reprezentują średnie 24 oocyty. SEM (2 partie). Nieprawidłowy test t był używany, gdy wskazano (* P <0,001). NS, nieistotne. Dyskusja Złożenie domeny i sygnał kierowania do. podjednostka. Trzy podjednostki zmutowanego kanału (A L535stop, a, i P) są zmontowane, co sugeruje, że druga domena transbłonowa (M2) i końcowa część COOH podjednostki a ENaC nie są koniecznie wymagane do złożenia. Jest to zgodne z poprzednimi eksperymentami przeprowadzonymi na. podjednostka (18). Proponujemy tutaj, że domena złożeń jest obecna w pierwszych 535 resztach. podjednostka. Mierzalne prądy obserwowano po wstrzyknięciu. L535stop. lub. w oocytach X. laevis. Prądy te mogą wynikać z preferencyjnego połączenia wstrzykiwanych. i . podjednostki z endogenną podjednostką. Pomimo pewnych dowodów na endogenne prądy wrażliwe na amiloryd (19), do tej pory nie zidentyfikowano znaczącej endogennej ekspresji podjednostek ENaC w oocytach Xenopus. 3 skondensowane podjednostki (A L535stop, P i P) wykryto na powierzchni komórki oocytu za pomocą testu wiązania przeciwciała, chociaż z obniżoną gęstością. Wskazuje to, że znaczna część zmutowanych kanałów dociera do błony komórkowej [podobne: domowe sposoby na zapalenie oskrzeli, cytaty na tatuaż po angielsku, damian znaczenie imienia ] [przypisy: sprawdzian z fizyki 1 gimnazjum, regulacja nerwowo hormonalna sprawdzian, środki czystości i kosmetyki sprawdzian ]