Grupa podobna do rodnika hydroksylowego utlenia białka ściany tętnicy małpy cynomolgus we wczesnej cukrzycowej chorobie naczyniowej cd

Preparat przechowywano w temperaturze około 70 ° C. Utlenianie białka in vitro przez rodnik hydroksylowy, rodnik tyrozylowy i ONOO .. Wszystkie reakcje (zawierające mg białka aortowego na mililitr) przeprowadzono w 37 ° C w buforze B (50 mM fosforan sodu [pH 7,4]), który przepuszczono przez kolumnę Chelex w celu usunięcia jonów metali. Bufor uzupełniono 5 mM lub 15 mM D-glukozą. Po inkubacji przez 2 godziny (rodnik hydroksylowy), 30 minut (rodnik tyrozylowy) lub 5 minut (ONOOa), reakcje zakończono przez dodanie 0,2 mM DTPA (pH 7,4), 300 nM katalazy i 0,1 mM BHT. Rodnik hydroksylowy wytworzono stosując bufor B zawierający 0,2 mM CuSO4 i 5 mM H2O2. Aby zahamować resztkową aktywność katalazy, do mieszaniny reakcyjnej włączono 3-amino-1,2,4-triazol (0,1 mM). Rodnik tyrozylowy wytworzono przez dodanie 0,1 mM H202 do buforu B uzupełnionego 20 nM mieloperoksydazy, 0,2 mM L-tyrozyny i 0,1 mM DTPA. Peroksynitryl zsyntetyzowano z azotynu 2-etoksyetylu i H2O2 (32) i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Nadtlenoazotyn rozmrażano bezpośrednio przed użyciem, a jego stężenie określano spektrofotometrycznie (<302 = 1670 M <1 cm 1, pozycja 33). Gdy wskazano, bufor B był uzupełniany 25 mM NaHCO3 przed dodaniem ONOO .. W celu analizy GC / MS białka strącono lodowatym kwasem trichlorooctowym (końcowe stężenie 10%) i hydrolizowano za pomocą kwasu, jak opisano powyżej. Derywatyzacja aminokwasów i analiza spektrometryczna mas. Aminokwasy wyizolowano przez ekstrakcję w fazie stałej z kwaśnych hydrolizatów i przekształcono w pochodne heptafluorobutyrylowe n-propylowe, jak opisano poprzednio (31). Pochodne określono ilościowo za pomocą jonizacji chemicznej jonizacji GC / MS rozcieńczonej izotopem jonów ujemnych (16). W przypadku fenyloalaniny użyto jonu o wartości m / z 383 (M . 3 HF) i izotopowo znakowanego jonu standardowego przy m / z 389; dla tyrozyny jon przy m / z 417 [M. . CF3 (CF2) 2CHO] i izotopowo znakowany jon wewnętrzny przy m / z 423; dla 3-nitrotyrozyny, jon przy m / z 464 (Mł 10) była mniejsza niż pmol dla całej grupy aminowej. kwasy. Analizy statystyczne. Wyniki przedstawiono jako średnie. SE. Różnice między dwiema grupami porównano stosując niesparowany test Studenta. Przeprowadzono wiele porównań stosując dwukierunkową ANOVA. Poziomy produktów utleniania korelowano z poziomami hemoglobiny glikowanej metodą analizy regresji liniowej, a metodę korelacji rang Spearmana zastosowano do danych nieparametrycznych za pomocą Sigma Stat (SPSS, Chicago, Illinois, USA). Wartość AP mniejsza niż 0,05 została uznana za znaczącą. Wyniki W celu oceny potencjalnej użyteczności utlenionych aminokwasów jako markerów utleniania białka in vivo, eksponowaliśmy rozpuszczalne białka tkanki aortalnej wyizolowane od niediabetycznych małp cynomolgus na różne układy utleniania in vitro i określono względną wydajność każdego produktu. Wykorzystano układ nadtlenek miedzi do wytworzenia rodnika hydroksylowego (0,2 mM CuSO4 i 5 mM H2O2), układu mieloperoksydaza-tyrozyna-H2O2 w celu wytworzenia rodnika tyrozylowego (0,1 mM H202, 20 nM mieloperoksydazy i 0,2 mM tyrozyny) i mM ONOO. do generowania reaktywnych form azotu. Aby określić wpływ D-glukozy na wydajność różnych produktów utleniania, uwzględniliśmy fizjologicznie odpowiednie stężenia (5 mM lub 15 mM) cukru w mieszaninach reakcyjnych. Ustaliliśmy również, czy dodanie 25 mM NaHCO3 do buforu reakcyjnego zmieniło wydajność utlenionych aminokwasów w białkach tkankowych, gdy ONOO. był reagentem. Wysokie stężenia wodorowęglanu / dwutlenku węgla są obecne in vivo, a dwutlenek węgla reaguje szybko z ONOO. utworzyć ONO2CO2 ., którego reaktywność różni się od ONOO. (33,34). orto-tyrozyna w białkach aortalnych utlenianych in vitro. Kiedy eksponowaliśmy białko pochodzące z tkanki aortalnej na rodnik hydroksylowy, głównym produktem była orto-tyrozyna (rysunek 1a). Peroxynitrite, ale nie rodnik tyrozylowy, również wytwarzał znaczną ilość tego nieprawidłowego aminokwasu. Glukoza w stężeniu (15 mM) podobnym do obserwowanego u ludzi chorych na cukrzycę i małp nie wpłynęła na wydajność produktu (ryc. 1a). Nie dodałeś również NaHCO3 do ONOO. system (rysunek 1a). Obserwacje te sugerują, że orto-tyrozyna jest głównym produktem reakcji utleniania, w której pośredniczy rodnik hydroksylowy, i który powstaje również w przypadku ONOO. jest utleniaczem. Figura Wydajność produktu orto-tyrozyny (a), meta-tyrozyny (b), o, o-ditirozyny (c) i 3-nitrotyrozyny (d) w tkance aorty utlenionej przez różne układy in vitro
[więcej w: jakie powinno być ciśnienie krwi, cytaty na tatuaż po angielsku, witamina c lewoskrętna w proszku ]
[więcej w: śmieszne znaczenie imion męskich, szklana pułapka 4 cda, świat fizyki 1 sprawdziany ]